1 細(xì)胞質(zhì)膜資料

1895 年 ,Overton 從研究細(xì)胞透性得出 " 細(xì)胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成 " 。

1925 年 Gorter&Grendel: 用脂單分子膜技術(shù)測(cè)定細(xì)胞膜中脂分子的總面積，提出： "細(xì)胞膜是由雙層脂分子組成 " 。

1935 年 Danielli&Davson ：從測(cè)定膜的表面張力得出細(xì)胞膜的 " 三明治結(jié)構(gòu)模型 "，即蛋白質(zhì)－脂 - 蛋白質(zhì)。

1959 年 Robertson: 用電鏡觀察生物膜提出 " 單位膜模型 " ，將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機(jī)構(gòu)統(tǒng)一起來

厚度： 2( 暗 ) 3.5( 亮 ) 2 （暗） =7.5

細(xì)胞質(zhì)膜的主要功能概括如下：

(1) 為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境 ;

(2) 選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸，包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；

(3) 提供細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，并完成細(xì)胞內(nèi)外信息跨膜傳遞；

(4) 為多種酶提供結(jié)合位點(diǎn)，使酶促反應(yīng)而有序地進(jìn)行；

(5) 介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接 ;

質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)。

2 膜蛋白

雖動(dòng)物細(xì)胞主要有 9 種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。

根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。

(1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。

(2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑 (detergent) 使膜解后才可分離出來。

獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對(duì)我們顯得非常的重要。

附注：使用分級(jí)抽提方法獲得的“膜蛋白"中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，仍然是蛋白組學(xué)的一個(gè)瓶頸，不管采用２－Ｄ技術(shù)也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray 都還不能有效解決這一問題。

二、蛋白抽提

談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時(shí)這些方法常常組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化。由于蛋白質(zhì)種類繁多，不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異，其溶解度也各不相同. 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性，同時(shí)可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機(jī)溶劑提取 .

但是針對(duì)膜蛋白的提取與細(xì)胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，zui后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣话愠Ｓ玫挠心懰猁}，CHAPS( 一種離子去污劑）， Emulgen 和 Lubrol 等表面活性劑。

1 、分離膜蛋白的方法（原則性）：

1 ）先分離膜，然后提?。蝗邕x用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。（例如：michael11 液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。收集 37% 與 41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白 ）

2 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。 從膜上提取蛋白有許多困難 . 在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來，然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定. 去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對(duì)所需要蛋白質(zhì)的提取效率來確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟 .雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)行純化，但zui終仍可能需要除去去垢劑 .這常常會(huì)引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的，他將不是一個(gè)問題 . 如果不是用于測(cè)序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠 .許多文獻(xiàn)和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑 . 然而，他們并不是普遍適用的 .在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì) . 如 triton X-100 在 280nm 處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm 處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類去垢劑 .

將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來 .這種做法的好處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入 .使用這種方法所獲得的膜蛋白，無論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ <5000Da ）要多 .一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足 0.1% ，所以充分的膜蛋白的提取，無疑對(duì)于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的 .第二種方法簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。一般的都是利用 4 度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于 TritonX114 水溶液，在溫度超過 20 度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。

3 ) 膜蛋白色譜 (Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如 SDS ）溶解膜蛋白后形成 SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（ P- 端），又具有陽離子鈣（ C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、 SDS 結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究 cAMP 的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與 SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在 SDS 分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級(jí)分離的目的。

層析柱提取 http://www.alomone。。ｃｏｍ/ （參步驟）

4) 順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。用 Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用標(biāo)準(zhǔn)液溶解提取高疏水性蛋白；zui后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，zui后可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。

5)centrifugal protein extraction

原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲破裂后，超高速離心

評(píng)價(jià)：盡管分級(jí) ( 胞漿和胞膜 ) 之間有清洗的步驟 , 但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點(diǎn) . 該方法相較 MOLLOYMP 教授在 1998 年 electrophoresis 上發(fā)表的分級(jí)抽提法減去了*步 ( 用 tris 抽提水溶性蛋白 ) 和zui后一步 (極難溶蛋白 ), 在操作上也作了簡(jiǎn)化 , 總而言之是一種不錯(cuò)的方法。（ codegreen ）

6)detergent- based ：提取時(shí)先裂解液裂胞膜（選用不同的去污試劑是關(guān)鍵），梯度離心分離細(xì)胞器 (ER)，然后分級(jí)抽提方法。例如，去掉細(xì)胞器之后的 DEBRIS 就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時(shí)不溶的部分。

總的感受：細(xì)胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。

到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學(xué)的一個(gè)瓶頸。

2 、分離膜蛋白的方法（操作）

1）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：

1、冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 A 中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融 2 次。

2、5000 轉(zhuǎn) 4 度離心，驅(qū)除核及未裂解的細(xì)胞。

3、取上清 12000 轉(zhuǎn) 4 度離心 10 分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 B 中。

4、12000 轉(zhuǎn) 4 度離心 10 分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 C 中提取后測(cè)蛋白濃度 ,SDS-PAGE 電泳，分裝后 -20 度保存?zhèn)溆谩?BR>
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)

buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA

buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

2 ）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：

1 、細(xì)胞放在冰上，去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次

2 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min

3 、刮下單層細(xì)胞， 4 度下 10 000g 5min 離心

4 、溶液 37 度水浴 10min 以分離水相和去污劑相，然后 37 度下 2 000g 離心 5min

5 、收集水相留作分析

6 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min 后加溫，在按步驟 6 再次離心

7 、按步驟 8 再次抽提去污劑相，用 buffer C 將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積

8 、用等量的 buffer A 分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)

試劑：

1 、 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制劑

2 、緩沖液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）

3 、 buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

3 ）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：

7M urea

2M thiourea

4%chaps

2.5%sb3-10

1000000 個(gè)細(xì)胞，可用此 buffer 1ml 。 冰浴勻漿。冰上置 30 分鐘。

4 度高速低溫離心 30min 。

取上清 -20 保存。

4 ）分離組織膜蛋白的方法：

1 、取組織，加入 10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。

2 、 J6-HC 離心機(jī) 800rpm ， 4 ℃離心 10min 后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。

3 、 100000g ， 4 ℃離心 1hr 。棄去上清，沉淀用適量的 Buffer B 重懸，冰上孵育 2hr 后分裝至 EP 管，Eppendorf 臺(tái)式離心機(jī) 10000rpm ， 4 ℃離心 30min 。

4 、收集所得上清液即為膜組份。

Buffer A ： 0.32M 蔗糖， 5mM Tris-HCl （ PH 7.5 ）， 120mM KCl ， 1mM EDTA,1mMEDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上預(yù)冷。

Buffer B ： 20mM HEPES （ PH 7.5 ）， 10% 甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/mlAprotinin 。 冰上預(yù)冷。

5 ）分離組織膜蛋白的方法：

RIPA

1XPBS

1%NP40

0.5 去氧膽酸鈉

0.1%SDS

以下用時(shí)加入

10mg/ml PMSF 異丙醇（終濃度 10ul/ml ）

Aprotinin （ 30ul/ml ）

1000mM Sodium Orthovandate （ 10ul/ml ）

冰凍組織 100mg/ 細(xì)胞 1000000 個(gè)，可用 RIPA buffer 1ml 。 冰浴勻漿。冰上置 30 分鐘。

4 度高速離心 30min ， 20000 轉(zhuǎn)低溫離心。

取上清 -20 保存。

6 ）分離細(xì)菌膜蛋白的方法：

1、于 20ml 營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)細(xì)菌， 37 ℃， 200rpm 。

2、10000g 、 20min 、 4 ℃離心，去上清。

3、20ml 預(yù)冷的 Tris-Mg 緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的 Tris-Mg 緩沖液。

④ 超聲波破碎細(xì)菌。

⑤ 3000g ， 10min 、室溫下離心去除未破碎細(xì)菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細(xì)菌外被成分）。

⑥ 超速離心 I ： 100,000g ， 60min ， 4 ℃，去除上清（胞質(zhì)成分），收集細(xì)菌外被成分。

⑦ 用 10ml 含 2 ％的 SLS 的 Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育 20-30min 。

⑧ 超速離心 II ： 70,000g ， 60min ，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細(xì)胞質(zhì)膜）。重復(fù)⑦、⑧兩步。

⑨ 充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用 0.1-0.2 ml 的 ddH2O 重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度 (mg/ml)=1.450D280-0.740 D260 測(cè)定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至 40ug/ul ，該蛋白質(zhì)樣品 -70 ℃貯存。

試劑

① Tris-Mg 緩沖液

10mM Tris-Cl

5mM MgCl2

pH 7.3 ， 4 ℃保存

② 2%(w/v) 十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)

7 ）來源于 Methods Enzymology (1974)

1、取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加40ml 介質(zhì)。

2 、用 Potter-Elvehiem 勻漿器，桿與壁間間隙 0.5 ～ 0.6 μ m,14.4kr/min 上下勻漿 4 ～ 6次，每次 5S 。

3、過濾勻漿液， 150g 離心 10min ，保留上清，沉淀部分加入 50 μ l 介質(zhì)，用勻漿器 1kr/min 勻漿 3 次， 150g離心 10min ，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。

4、合并 3 次上清液， 2kg 離心 10min ，棄上清，沉淀部分溶于 100 μ l 介質(zhì)，離心 10min ，棄上清，留沉淀。

5、將沉淀部分加入 70% 蔗糖 15 份，然后分別置于三個(gè)離心管中，上面依次疊加 54% 、 49% 、 45% ， 41% ， 37%蔗糖溶液各 2 、 2 、 5 、 5 、 3 份。

6、 700kg 離心 90min ，分離介質(zhì)在 1.16 ～ 1.18 之間形成介面。

7、收集 d 為 1.16 ～ 1.18g/ml 之間的細(xì)胞膜，加 30 倍的介質(zhì)以 2.5kg 離心 10min ，洗滌 2 次。

8、保存于 2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5 緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究分析

8 ）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法：（所有操作都在 4 攝氏度下進(jìn)行）

1. 在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述操作，直至組織碎成 1mm3 大小的碎片，且無可見的血。

2. 加入 5 倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的 Dounce 氏玻璃勻漿器中，抽研 10-20 次，勻漿組織。

3. 勻漿 4 攝氏度 600g 離心 10min ，上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。

4. 上清 4 攝氏度 8000g 離心 10min ，沉淀線粒體。棄沉淀。

5. 上清 4 攝氏度 10000g 離心 20min ，棄上清。

6. 用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再次 4 攝氏度， 10000g 離心 20min ，棄上清。

7. 用小體積的適宜緩沖液重新*勻漿沉淀。

8. 粗制的樣品可于干冰 / 乙醇中速凍，保存于 -80 攝氏度。

9 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。

簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。

原理： 4 度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于 TritonX114 水溶液，但在 37 度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。

方案

1 、放射性標(biāo)記受試細(xì)胞

2 、將標(biāo)記的細(xì)胞放在冰上

3 、去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次

4 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min

5 、刮下單層細(xì)胞， 4 度下 10 000g 5min 離心

6 、溶液 37 度水浴 10min 以分離水相和去污劑相，然后 37 度下 2 000g 離心 5min

7 、收集水相留作分析

8 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min 后加溫，在按步驟 6 再次離心

9 、按步驟 8 再次抽提去污劑相，用 buffer C 將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積

10 、用等量的 buffer A 分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)

試劑：

1 ） 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制劑

2 ）緩沖液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）

3 ） buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

10 ）植物中：高度純化的質(zhì)膜是質(zhì)膜蛋白研究的基礎(chǔ)，制備純化方法也很多，植物材料中以

1、蔗糖密度梯度離心、

2、水溶性雙水相法、

3、自由流電泳等方法為主。