實(shí)驗(yàn)室透析常見問題解答

上海優(yōu)高玖貿(mào)易代理美國SPECTRUMLABS透析產(chǎn)品，咨詢

Q1：如何準(zhǔn)備透析膜管？

透析膜管的準(zhǔn)備因膜管材質(zhì)和生產(chǎn)工藝的差別而有所不同。注意，我們不推薦煮沸處理，因其可能損壞膜管并改變膜孔徑。

1. 生物技術(shù)級RC、CE及PVDF膜可以用DI水沖洗15-30分鐘，去除防腐劑*。
2. Spectra/Por^R 7 標(biāo)準(zhǔn)級RC膜已經(jīng)預(yù)處理，去除了重金屬和硫化物，只需在去離子水中浸泡15-30分鐘，去除*即可。
3. Spectra/Por^R 1-6 標(biāo)準(zhǔn)級RC膜，一般情況下，在水中漂洗足以去除甘油或防腐劑，而對于親和研究之類極其敏感的透析應(yīng)用或者重金屬及硫化物會影響透析樣品下游分析的應(yīng)用，可能需要一些額外的處理以去除在生產(chǎn)過程中引入的痕量水平重金屬及硫化物，仕必純提供兩種膜預(yù)處理溶液：重金屬漂洗液及硫化物清除液，具體產(chǎn)品信息請參考“膜透析配件"網(wǎng)頁說明。

Q2：透析的原理是什么？一般需要多長時間才能完成？

透析是指溶質(zhì)在濃度梯度的驅(qū)使下，選擇性擴(kuò)散通過半透膜，從而達(dá)到大/小分子分離，膜兩側(cè)濃度平衡，即小顆粒的溶質(zhì)通過膜，而大分子物質(zhì)不能通過，被截留在膜另一邊。

如果將樣品置于透析膜管內(nèi)，通過置換膜管外部的透析緩沖液，可將小顆粒物質(zhì)清除，從而達(dá)到純化大分子物質(zhì)的目的。一般來說，一天之內(nèi)置換3-5次緩沖液，然后在室溫條件下，放在攪拌臺上隔夜透析，即可達(dá)到的透析結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)的透析操作一般需要16-24小時。許多因素會影響透析效率，包括：擴(kuò)散系數(shù)、pH值、溫度、時間、物質(zhì)濃度、樣品體積、透析緩沖液體積、透析緩沖液的置換次數(shù)、膜表面積、膜厚度、分子帶電荷及緩沖液攪拌速率。

Q3：透析一個樣品需要多少體積的透析緩沖液？緩沖液置換頻率怎么安排？

透析緩沖液的體積越大，小分子擴(kuò)散的驅(qū)動力越大。我們一般推薦緩沖液和樣品的體積比為100:1。當(dāng)擴(kuò)散速率降低，膜兩側(cè)溶液趨于平衡時，通過置換緩沖液，可維持小分子擴(kuò)散驅(qū)動力和透析速率。我們一般推薦在12-24小時內(nèi)，置換緩沖液2到3次，具體安排如下：

*次緩沖液置換：透析開始后2-3小時

第二次緩沖液置換：透析開始后4-5小時

zui后一次緩沖液置換：透析隔夜之前

Q4：如何選擇正確的截留分子量（MWCO）？

截留分子量應(yīng)該竟可能的大，以使透析速率zui大化。但是，為了獲得zui大的樣品回收率，選擇的截留分子量應(yīng)至少為需純化的大分子物質(zhì)分子量的一半。對于需對幾種分子進(jìn)行分離的應(yīng)用，分子之間的分子量差至少為5倍，才能完成有效的膜透析。若不能滿足分子量差的要求，可能需要使用其它的分離技術(shù)，如色譜方法或切向流過濾。

Q5：那種膜的蛋白質(zhì)結(jié)合率zui低？

每種膜對不同的分子具有不同的親和性。對于球狀蛋白，相對的結(jié)合親和性由低到高為 CE< RC

Q6：怎樣為膜管選擇合適大小的膜夾？

標(biāo)準(zhǔn)RC膜(Spectra/Por 1-7)和生物技術(shù)級RC膜由柔韌的再生纖維素聚合物制造，可使用任何一種透析膜夾密封。生物技術(shù)級CE & PVDF膜由相對剛性的聚合物制造，需要使用相對溫和的通用膜夾。鑒于通用膜夾對于所有類型的膜管都能起到很好的密封作用，如不確定選擇哪種膜夾合適，使用通用膜夾即可。標(biāo)準(zhǔn)膜夾一般只用于標(biāo)準(zhǔn)級RC膜管。

膜夾的密封寬度一般需比膜管的扁平寬度長4-10 mm。通用膜夾的zui小密封寬度為50 mm。對于所有扁平寬度規(guī)格的仕必純生物技術(shù)級膜管，均有相應(yīng)的膜夾可供選擇。

Q7：透析膜的保存時間為多長？

干包裝的透析膜可保存5年。濕包裝的透析膜（0.1% 的*溶液）保存期限為3年。輻照滅菌的透析膜可保存1.5年。

Q8：透析膜變干或凍存之后是否仍可使用？

濕潤的透析膜變干之后，孔徑受到不可逆的影響，膜變得脆弱易碎，容易泄露，不推薦繼續(xù)使用。

透析膜凍存之后，冰晶會使膜破裂，導(dǎo)致泄露，此時不推薦使用該膜。

Q9：透析膜*不含內(nèi)毒素嗎？

仕必純確認(rèn)所有透析膜不含有內(nèi)毒素，符合普通實(shí)驗(yàn)室使用規(guī)格要求。

Q10：我需要擔(dān)心透析膜上的皺紋、滾痕或折線嗎？

只要膜是完整的，滾痕或者折線不會影響膜的擴(kuò)散特性。

Q11：CE膜比RC膜更具剛性，且不透明嗎？

纖維素酯（CE）膜內(nèi)的聚合物交聯(lián)形成相對剛性的晶格，而再生纖維素（RC）聚合物形成更加柔韌的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。不透明性是由網(wǎng)格中孔眼的大小所決定的，孔眼越大，膜越不透明。

Q12：透析膜可以化學(xué)密封或熱密封嗎？

CE和RC透析膜只能機(jī)械密封，但PVDF透析膜可以機(jī)械密封或熱密封，通常用于樣品“封裝"目的。

Q13：處理相同的蛋白樣品，Spectra/Por^R 透析膜可重復(fù)使用嗎？

我們不推薦重復(fù)使用透析膜，因?yàn)樘囟ǖ奶幚聿僮骺赡軙δぴ斐晌廴?，一定的透析條件（pH值、溫度、化學(xué)接觸等）也會對膜的完整性造成損害，和/或?qū)е滦孤貏e是在打開和重新夾上膜夾時。

Q14：膜孔徑有多，什么是MWCO？

透析膜微觀下呈海綿狀結(jié)構(gòu)，因此，更適合通過評定其截留性能來間接地定義“孔徑"，亦即“截留分子量"（Molecular Weight Cut Off，MWCO）。MWCO定義為在17個小時內(nèi)，膜截留率為90%的溶質(zhì)分子量?；诖硕x，選擇透析膜時，MWCO應(yīng)小于需要截留的分子的大小。

Q15：透析膜Spectra/Por^R  2和4有什么區(qū)別？

Spectra/Por^R  2和4都有12-14 kD的截留分子量。Spectra/Por^R 透析膜更適合溫和透析，Spectra/Por^R 2可提供特定的更大和更小的扁平寬度，和/或滲透性；也就是說，Spectra/Por^R 2的水滲透性比Spectra/Por^R 4更*。

Q16：關(guān)于膜表面積和樣品量之間的關(guān)系有沒有經(jīng)驗(yàn)法則？

表面積與體積的比值取決于膜管扁平寬度。如果有兩段相同長度的膜管，扁平寬度較小的膜管具有較高的比表面積，而扁平寬度較大的膜管比表面積相對較小，也就是說，前者的透析速率更快。原因是扁平寬度較小的膜管，溶質(zhì)的擴(kuò)散距離較短，溶質(zhì)之間通過膜孔的競爭也較小。而扁平寬度大，亦即溶質(zhì)到達(dá)膜表面的距離也較長，溶質(zhì)之間對膜孔的競爭也較大。一般而言，比表面積越大，透析越快。

Q17：如果膜兩側(cè)的摩爾滲透壓濃度相等，但濃度梯度仍然存在，物質(zhì)的通過效率如何？

大多數(shù)透析結(jié)束時膜兩側(cè)滲透壓相同。透析過程是由膜管內(nèi)外兩側(cè)的濃度梯度驅(qū)動的。如果滲透壓力有很大的差別，水會通過膜以平衡膜兩側(cè)的滲透壓。如果過多的水通過膜，透析膜管可能會隨水運(yùn)動的方向增大或縮小，在體積增加到一定程度時，有可能導(dǎo)致膜夾松動或膜管破裂。

Q18：進(jìn)行超濾時，透析膜能承受多大的壓力？

透析膜設(shè)計(jì)不適合用于壓力過濾。在不影響截留分子量的前提下，zui大推薦壓力為1.5 psi。

Q19：一般推薦使用哪種透析液（緩沖液）？

生物分子必須保存在嚴(yán)格的pH值控制條件下，以穩(wěn)定其分子極性。典型的透析緩沖液pH范圍為6-8。以下為常用的幾種可以作為緩沖液的生化溶液：

• 水
• PBS
• TBS
• HEPES
• 氨基酸緩沖液

Q20：為什么使用微米vs道爾頓（MW）單位，怎么轉(zhuǎn)換？

溶解的分子大小以分子量來定義，單位為道爾頓，而顆粒和細(xì)胞大小常以直徑來定義，由于分子的結(jié)構(gòu)和形態(tài)不同，相同分子量的物質(zhì)，分子大小和形態(tài)可能相差較大，兩者之間沒有的對應(yīng)關(guān)系。出于這個原因，許多常見的生物材料都已特別定性，并將大約的尺寸標(biāo)注在轉(zhuǎn)換表上作為估算的參考，以用于透析、超濾和微濾應(yīng)用。道爾頓與微米單位之間的轉(zhuǎn)化，請參考仕必純“孔徑表"。

Q21：對于鹽濃度較高的樣品，*的透析方法是什么？

如果可能，我們推薦使用低鹽濃度的緩沖液。不推薦直接使用純DI水作為緩沖液，因?yàn)闈B透壓力可能將水引入膜管，使樣品體積膨脹并可能導(dǎo)致膜管破裂。使用一系列濃度逐漸降低的溶液作為緩沖液可防止?jié)B透壓力導(dǎo)致的膜管膨脹。每次緩沖液置換，可將溶質(zhì)濃度降低十分之一，也就是說，透析一個5M NaCl的樣品，可使用500 mM NaCl的緩沖液。

Q22：可以使用繩子結(jié)扎膜管，而不使用膜夾嗎？

我們不推薦使用繩子結(jié)扎膜管。因?yàn)槔K結(jié)對膜管的損害具有很大的不確定性，并且可能不能提供有效的密封，而導(dǎo)致泄露。只有膜夾才能提供足夠的密封性，從而保護(hù)樣品。

Q23：透析膜管應(yīng)該剪多長？

對于每種膜管扁平寬度，仕必純提供相關(guān)的容積/長度比，可方便計(jì)算透析樣品所需的膜管長度。如果扁平寬度為16 mm，容積/長度比為0.79 ml/cm，要容納5 ml的樣品，則需要大約6.5 cm長的膜管。但是，為保持樣品漂浮，一般需要在頂部空間預(yù)留10-20%膜長（約為1 cm）。此外，也需在兩端為膜夾各預(yù)留2 cm。所以總的膜管長度應(yīng)至少為11.5 cm。

可根據(jù)以下公式計(jì)算膜管長度：

總長度=（樣品體積）/（容積/長度）+（額外的10-20%）+4 cm

瀏覽網(wǎng)頁，使用仕必純透析膜管計(jì)算器，根據(jù)樣品體積和扁平寬度，計(jì)算所需的膜管長度。